猪痘主要根据流行病学及临诊症状进行诊断。在同一时期内，较多的仔猪先后发病，在发病猪群中，常可见到猪体皮肤上有明显的痘疹变化，根据这些症状就可以确诊。
1、组织学检查取有病变的皮肤，做成组织切片，可见表皮棘细胞中，有典型的胞浆内包涵体。
2、病毒分离：取患病初期病料做成混悬液，离心后取上清液，加入适量抗生素处理后，然后接种在猪同源和异源细胞培养；猪痘病毒只能在同源细胞中经多代盲传继代适应后，才能产生明显的细胞致病作用，细胞病变包括核空泡化，形成嗜酸性胞浆内包涵体，胞浆收缩成线状，最后细胞死亡。而痘苗病毒在同源和异源细胞培养中，在第一代接种时，便可增殖，并产生明显的细胞致病作用。
将经过处理的病料，接种鸡胚时，猪痘病毒不能在鸡胚中继代。痘苗病毒能在鸡胚绒毛尿囊膜上增殖，形成直径达3～4mm的痘斑，中心坏死。
3、动物接种用鸡和家兔皮肤感染试验，痘苗病毒在接种处可产生典型的痘疹；而猪痘病毒则不能，因其不感染鸡和家兔。 imuyi.com
将乳猪的耳部和股内侧皮肤划破，涂擦上述病料，如出现痘疹即可确诊。
