根据疾病的临诊症状，结合流行病学，可做出初步诊断，确诊必须进行实验室检查。同时要注意与猪细小病毒、流行性乙型脑炎病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、弓形虫及布鲁氏菌等引起的母猪繁殖障碍相区别。
1、病毒分离鉴定
病毒的分离是诊断伪狂犬病的可靠方法。患病动物的多种病料组织如脑、心、肝、脾、肺、肾、扁桃体等均可用于病毒的分离，但以脑组织和扁桃体最为理想，另外，鼻咽分泌物也可用于病毒的分离。
病料处理后可直接接种敏感细胞，如猪肾传代细胞(PK-15和IBRS-2)、仓鼠肾传代细胞(BHK-21)或鸡胚成纤维细胞(CEF)，在接种后24～72h内可出现典型的细胞病变。若初次接种无细胞病变，可盲传3代。
不具备细胞培养条件时，可将处理的病料接种家兔或小鼠，根据家兔或小鼠的临诊表现做出判定，但小鼠不如家兔敏感。分离到病毒后再用标准阳性血清做中和试验以确诊本病。
2、组织切片荧光抗体检测
取患病动物的病料如脑或扁桃体的压片或冰冻切片，用直接免疫荧光检查。其优点是快速，在几小时内即可获得可靠结果，对于新生仔猪，其敏感性与病毒分离相当，但对于育肥猪与成年猪，该法则不如病毒分离敏感。
3、PCR检测猪伪狂犬病病毒
利用PCR可从患病动物的分泌物如鼻咽拭子或组织病料中扩增猪伪狂犬病病毒的基因，从而对患病动物进行确诊。PCR与病毒分离鉴定相比，具有快速、敏感、特异性强等优点，能同时检测大批量的样品，并且能进行活体检测，适合于临诊诊断。
4、血清学诊断
多种血清学方法可用于伪狂犬病的诊断，应用最广泛的有中和试验、酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验、补体结合试验及间接免疫荧光等。
其中血清中和试验的特异性、敏感性都是最好的，并且被世界动物卫生组织(OIE)列为法定的诊断方法。但由于中和试验的技术条件要求高、时间长，所以主要是用于实验室研究。
酶联免疫吸附试验同样具有特异性强、敏感性高的特点，3～4h内可得出试验结果，并可同时检测大批量样品，广泛用于伪狂犬病的临诊诊断。 imuyi.com
另外，近几年来，乳胶凝集试验以其独特的优点也在临诊上广泛应用，操作极其简便，几分钟之内便可得出试验结果。
5、鉴别诊断
猪伪狂犬病病毒鉴别诊断方法是在使用基因标志疫苗的基础上应用的一类诊断方法。由于PRV中存在多个非心需糖蛋白基因，缺失这些基因的病毒突变株不能产生被缺失基因所编码的糖蛋白，但又不影响病毒在细胞上的增殖与免疫原性。将这种基因缺失标志疫苗注射动物后，动物不能产生针对缺失蛋白的抗体。因此，可通过血清学方法将自然感染野毒的血清学阳性猪与注苗猪区分开来。
目前，缺失疫苗缺失的糖蛋白基因主要为gE和gG基因，也有缺失gC、gB基因的。针对缺失的糖蛋白已利用大肠杆菌或酵母等表达系统的表达产物建立了相应的鉴别诊断方法：gE-ELISA(酶联免疫吸附试验)、gG-ELISA、gC-ELISA、gB-ELISA以及gE-LAT(乳胶凝集试验)、gG、LAT等，实验证实这些方法的特异性强、敏感性高，可用于临诊检测，同时乳胶凝集还具有简单、快速的特点。
目前，在我国已有gE-ELISA、gG-ELISA和gE-LAT、 gG-LAT问世。
